免疫检查点抑制剂疗法（CPIS）的出现，给恶性肿瘤的治疗和总体生存带来了很多惊喜，但是不可否认，这些与某些疗效预测指标和预后因素是息息相关的，其中，肝转移就是其中之一，在临床上，大部分恶性肿瘤合并肝转移的患者，比如黑色素瘤、肺癌、肾癌等，接受免疫治疗的疗效都是比较差的，明显比没有肝转移的患者差很多，为什么呢？现在终于有答案了！ 《SCIENCE IMMUNOLOGY》2020年10月发表的一篇美国加州大学的研究报告就正好做出了解释。 肝转移可调节全身抗肿瘤免疫，而这些患者CPI抵抗背后的机制基础还不清楚。以前对肝脏耐受性的研究要么集中在癌症以外的环境（如传染病、移植、自身免疫性疾病），要么就是提示肝转移前的潜在可能和癌症相关的免疫抑制是基于肝实质范围内的局部效应。但是这些研究均不能解释肝脏耐受性对全身或非稳态抗肿瘤免疫的潜在影响，更不能解决临床上的问题。因此，我们迫切需要了解肝转移CPI治疗失败的机制，并找出可能提高疗效的策略。 一、肝脏肿瘤降低远处抗肿瘤免疫以及抗PD-1免疫治疗的全身反应 图1 该研究发现，将同基因MC38肿瘤细胞皮下注射给无免疫能力的C57BL/6（B6）小鼠，同时将MC38细胞注射到肝脏或肺部（图1A），肝脏内肿瘤小鼠的远处SQ肿瘤的肿瘤生长明显增加（图1B）。 既往研究表明，活化标记物PD-1和CTLA-4在CD8+TILs上的高水平表达与肿瘤免疫有关，并预测对CPI有更好的疗效。 该研究分析了三组肿瘤浸润CD8+T细胞表面PD-1和细胞内CTLA-4的表达发现，与患有肺肿瘤的小鼠和对照鼠（仅限SQ肿瘤）相比，携带肝脏肿瘤的小鼠的SQ-CD8+TIL上PD-1和CTLA-4表达的百分比显著降低（图1C）。 为了验证抗PD-1免疫治疗对该模型的影响，研究者对三组小鼠注射了抗小鼠PD-1单克隆抗体（mAb），发现携带SQ和肝脏肿瘤的小鼠对抗PD-1单药治疗不敏感（图1 D和E），且肝肿瘤小鼠存活率降低和抗PD-1应答率低与肝毒性或肝脏疾病无关功能。从荷肝肿瘤小鼠分离的SQ-CD8+TIL上，PD-1和CTLA-4共表达细胞的频率显著降低，CTLA-4和PD-1的平均荧光强度（MFI）较低（图1F） 图2 为了研究肿瘤负荷的增加是否是免疫抑制的原因，将等量的肿瘤植入不同的宿主解剖部位，以检测对远处SQ部位的免疫抑制作用。免疫缺陷型NOD-scid-gamma（NSG）或Rag-1–/−小鼠植入继发性肝肿瘤后，SQ肿瘤生长没有显著差异（图2B），这表明远端SQ部位肿瘤生长的调节依赖于适应性免疫。将ir辐射的MC38肿瘤细胞单独植入肿瘤内肿瘤生长显著增加（图2B）。10倍种植-少辐射MC38肿瘤细胞显示出相似的结果（图2C）。将一个无关的B16F10肿瘤植入肝脏并不能促进远处SQ部位的肿瘤生长（图2D），说明肝脏介导的免疫抑制是肿瘤抗原特异性的。 图3 除上述PD-1和CTLA-4外，其他激活标志物，包括诱导性T细胞协同刺激物（CD278)/ target=_blank class=infotextkey>ICOS）和效应细胞因子，也被证明因肝脏肿瘤的存在而改变，并与抗肿瘤反应相关。 在肝转移小鼠中，CTLA-4、CD278)/ target=_blank class=infotextkey>ICOS和干扰素γ（IFNγ）的表达在分离的CD8+T细胞上显著降低（图3 B、C）。而且基于多种激活标记物PD-1、CTLA-4、ICOS和Ki-67的共同表达，大多数高活性T细胞亚群受到的影响最为显著。常规CD4+TILs在SQ肿瘤内荷肝肿瘤小鼠的ICOS表达较低，但PD-1表达较高（图3B）。表明传统CD4+TIL上ICOS的表达与增强的抗肿瘤免疫有关，而PD-1的高表达与抗肿瘤反应的降低相关。 虽然Foxp3+Tregs的百分比和绝对Treg数无显著差异（图4 A和B），但肝转移小鼠的肿瘤组织中PD-1、CTLA-4和ICOS的表达显著高于对照组（图3D）。在第二个肿瘤模型B16F10黑色素瘤模型中进行了类似的实验，观察到了相似的结果，即小鼠与同种肝肿瘤共同注射后，SQ肿瘤的生长显著增强，并且降低了激活标记物和细胞因子在与SQ肿瘤相关的细胞毒性T细胞中的表达（图S5）。 四、Tregs控制肝肿瘤远处肿瘤免疫的抑制 大量证据表明，Tregs在肝脏免疫耐受中起着重要作用，并能抑制CD8+T细胞活性和细胞毒性。因此，在Foxp3（FP3-DTR）的控制下，使用表达白喉毒素（DT）受体的小鼠株选择性地消耗Tregs，以检测Tregs在系统抑制中的潜在影响。结果表明Tregs参与了肝脏肿瘤特异性抑制（图3G）。此外，基于ICOS、IFNγ和CD107a表达的显著增加，Tregs的缺失恢复了肿瘤特异性CD8+T细胞的激活和功能状态（图3 H和I）。DT处理组PD-1表达较低。这一结果可能是由于肿瘤负荷减少（由Treg耗竭引起）引起。总的来说，在肝脏肿瘤存在的情况下，Tregs在调节远处肿瘤特异性CD8+T细胞免疫中起着关键作用。 五、Treg缺失或失活逆转肝脏肿瘤相关的全身免疫抑制 以上结果提示，Tregs可能是抗PD-1单药治疗不能诱导肿瘤消退的原因。因此，该研究使用两种独立的方案来选择性地破坏Tregs，看看它是否能与抗PD-1治疗协同作用。结果表明，在抗PD-1单药无效的肝肿瘤介导免疫抑制中，包括PD-1检查点阻断和Treg功能耗竭或破坏的联合策略可以增强持久的抗肿瘤免疫。 为了验证Treg耗竭对抗CTLA-4活性，比较两种药物的抗肿瘤作用，发现只有Treg缺失的IgG2a抗体能够在两个部位实现肿瘤的完全排斥。 肝脏Tregs表型分析和抑制抗肿瘤免疫效应 鉴于Tregs在肝肿瘤模型中的全身免疫抑制中起着重要作用，该研究试图直接比较有无肝肿瘤的小鼠的体内抑制能力，以确定Treg群体是否存在功能差异。结果表明，肝脏肿瘤的存在诱导了一个高度活跃的Tregs群体，在每个细胞的基础上更有效地抑制抗肿瘤免疫。 肿瘤中天然免疫细胞的微环境影响抗肿瘤免疫中表达基因和蛋白质 先天性肿瘤微环境中的免疫细胞重编程与抗肿瘤反应高度相关。因此，该研究利用scRNA序列分析了先天性免疫室细胞的转录组，发现仅在SQ肿瘤的单核细胞亚群中，表达与免疫抑制相关基因的细胞较少组，包括Socs3、Xbp1、Rhoh、Wfdc17、GOs2和Acod1，表明肝肿瘤诱导的免疫抑制可能是Tregs和MDSC cross-tALK的结果。 肝肿瘤相关的Treg控制远端抗原特异性免疫是由耐受性CD11b介导的MDSCs 以前的研究表明Tregs可以通过改变抗原呈递细胞（APCs）间接地对效应T细胞产生肿瘤抗原特异性抑制。提示系统性抗原特异性免疫调节机制可能与Tregs和MDSCs相互协调。该研究用14色荧光笔对SQ肿瘤微环境中的髓系/单核细胞/巨噬细胞系细胞进行了观察，结果发现，肝肿瘤组的两组细胞CD11b+Ly6G+Ly6C-粒细胞MDSCs（G-MDSCs）显著增加以及CD11b+Ly6G−Ly6C+单核MDSCs（M-MDSCs）。CD11b+MDSC浸润增加，CD80/86表达增加，仅在合并肝脏肿瘤的情况下发生，而在其他解剖部位肿瘤并没有。 对不稳定SQ肿瘤的分析表明，Tregs的耗竭导致浸润性MDSCs的百分比降低（图6C）。此外，肿瘤微环境中剩余的CD11b+单核细胞表达更高水平的CD80/86，提示它们在肿瘤微环境中的功能可能被重新编程为成为能够向T细胞提供共刺激的APCs（图6D）。 为了验证Tregs、CTLA-4和MDSCs的关系，该研究比较了两种不同类型的小鼠抗CTLA-4抗体克隆9D9。无论是用Treg缺失抗体还是非缺失抗体治疗，CD45+CD11b+MDSCs上的CD80/86表达增加；然而，只有Treg缺失IgG2a抗体导致超高压单核细胞数量减少（图6，G至I）。类似于反-CTLA-4 9H10抗体，只有Treg消耗IgG2a抗体。当结合抗PD-1抗体治疗时，治疗能够在大多数治疗小鼠的两个部位实现肿瘤的完全排斥。因此，虽然CTLA-4阻断可以恢复MDSCs上共刺激表面CD80/86的表达，但Treg的耗竭可能是进一步阻止任何抑制性MDSCs进入肿瘤微环境的必要条件，并且在存在肝脏肿瘤的情况下实现最大的全身抗肿瘤免疫。 在肿瘤转移部位进行的抗肿瘤免疫治疗可以显著降低肿瘤远处转移的免疫反应取决于Tregs和MDSCs之间的cross-tALK。肝脏继发性肿瘤导致肿瘤特异性免疫和SQ位点抗PD-1免疫治疗反应的显著抑制。 总之，肝脏肿瘤不仅损害肝内免疫功能，还影响远期的抗肿瘤免疫，并导致临床上系统性抗PD-1治疗的疗效降低。为了揭示导致CPI免疫治疗抵抗的潜在耐受机制，本研究利用双肿瘤免疫活性小鼠模型，发现对肝脏内肿瘤抗原存在的免疫反应导致抗肿瘤的全身抑制免疫。免疫抑制是抗原特异性的，与调节性T细胞（Tregs）的协同激活和肿瘤内CD11b的调节有关。功能失调的免疫状态可能抗PD-1单一疗法不能逆转，除非Treg细胞被耗尽（抗CTLA-4）或使用zeste2（EZH2）抑制剂增强子的功能性抑制，可恢复全身抗肿瘤免疫和CPI反应。因此，临床上治疗恶性肿瘤肝转移想要取得更好的疗效应该选择抗PD-1联合其他靶向治疗。 尽管在临床上肝转移的疗效较差，但是与传统治疗或不治疗相比较，免疫治疗对这部分患者还是能带来一线希望，比如在KEYNOTE 001、002、006临床研究队列亚组分析中，虽然PD-1(帕博丽珠单抗)对黑色素瘤及NSCLC肝转移患者，均显示了较差的免疫治疗响应，但其缓解率也超过了其他传统疗法所报告的缓解率。结合目前的相关研究，免疫治疗的联合用药是肝转移治疗的趋势。 那与化疗联合呢？ IMpower130及IMpower132研究中，肝转移亚组的患者使用免疫治疗联合化疗并未取得显著的生存获益。 而联合化疗+抗血管新生呢？ IMpower150研究，肝转移亚组获益优于非肝转移亚组的数据，可能由于抗血管生成药物与免疫治疗药物具有协同抗肿瘤的作用。 联合局部治疗也是可选择方案之一，比如立体定向身体放疗（SBRT）、经动脉化学栓塞（TACE）等联合免疫治疗在肝转移患者也能取得一定疗效。 目前有PD-L1/CTLA-4双抗体、PD-L1/TGF-B双抗体等临床研究正在如火如荼进行当中，我们也希望这些新的药物能够给肝转移患者带来更好的疗效。
二、肝脏促进远期肿瘤抗原特异性免疫抑制，而不受肿瘤负荷的影响
三、肝转移与TILs的表型变化有关
六、临床上肝转移的治疗展望